先天性巨結腸的鑑別診斷的主要方法是做X射線成像檢查，肛門直腸測壓和病理檢查。 X線成像檢查，主要包括X線腹部平片和X線鋇劑灌腸，診斷的準確率是比較高的。另外診斷先天性巨結腸的金標準是病理檢查或者活組織檢查。如果懷疑患了先天性巨結腸，則可以通過X射線成像，或肛門直腸測壓法進行初步診斷。為了獲得更準確的診斷，需要進行病理檢查。